La mezcla impura para ser
analizada por cromatografía de columna es
aplicada a la parte de arriba de la columna.
El solvente liquido (eluyente)
pasa por la columna por gravedad o por la
aplicación de presión de gas (normalmente
nitrógeno o aire comprimido).
La columna de cromatografía
se llena del adsorbente de la fase
estacionaria y el producto impuro, el cual,
actúa como la solución, es puesto encima de
la fase estacionaria. Como solvente (la fase
móvil) es largada por los compuestos de la
columna y el producto impuro lentamente baja
pasando por la fase estacionaria. Varios
factores determinan la velocidad de cada
compuesto que baja la columna, los cuales
incluyen el tamaño de partícula de la fase
estacionaria, la polaridad de la fase móvil
y el ritmo de flujo del solvente. Cada
compuesto se
separará diferentemente entre las
fases móviles y estacionarias. Tomaran
tiempos diferentes para pasar por la columna
y cada partición es después colectada
separadamente. La ventaja de cromatografía
flash es que la presión es usada para
empujar rápidamente todo el aire del
material de la fase estacionaria (sílice o
alumina) ayudando a avanzar el proceso de
purificación.
La retención de los
componentes en los platos de TLC es medida
en términos de factor de retención (Rf).
Cuando la cromatografía flash es usada, la
retención es medida en volumen de columna
(CV). Los dos factores, Rf y CV tienen una
relación reciproca:
CV=1/Rf
Por esto los métodos desarrollados usando
TLC son generalmente transferidos a
cromatografía flash.
Una Rf bajo (0.15-0.35) es
preferido porque un Rf bajo
significa que hay un CV alto por la
relación reciproca. CV’s grandes indican un
aumento en el tiempo de contacto con la fase
estacionaria, mejorando los cambios de la
resolución de los compuestos. CV es una
medida de la resolución de los compuestos
desde que el CV es una medida de la
retención de los compuestos. Con el uso de
cromatografía flash, CV dicta el rango
posible de la carga de prueba para cualquier
tamaño de cartucho. Una columna de volumen
grande es deseable para dos compuestos
contiguos.
-
Rapad
Chromatographic Technique for
Preparative Separations with Moderate
Resolution, Still WC, Kahn, M, Mitra, A,
Journal of Organic Chemistry,
Vol. 43, No 14 1978 pp. 2923-25
La Cromatografía Flash
basada de sílice demanda el uso de
materiales consistentes en grado, tamaño de
partícula y calidad. En respuesta a las
demandas y pedidos de los cromatógrafos, DAI
ha desarrollado un sílice de grado flash
(Flash Grade Silica) superior. Este nuevo
producto asegura columnas y cartuchos llenos
de sílice mas
uniformes, proveyendo los químicos de
separación y cromatógrafos con mejor
capacidades de resolución y separación.
La partícula del sílice de
DAI grado flash uniforme mide 32-63
micrones. Mas del 90% de todas las
partículas de sílice de DAI grado flash
quedan dentro del rango de tamaño definido.
Para usted, cromatógrafo, los beneficios son
obvios.
Nuestro producto contiene
niveles muy bajos de partículas que miden
menos de 32 micrones. Estas partículas muy
pequeñitas causan presión trasera y aumentan
a la coagulación de la columna y son
especialmente peligrosas cuando se hace
cromatografía liquida de presión media
(médium pressure liquid chormatography –
MPLC) o cuando columnas de vidrio se usan
para separación de productos. Estas
partículas sumamente pequeñas pueden pasar
por los filtros y contaminar la purificación
del producto final haciendo que todo el
proceso de aislar un producto sea en vano.
DAI tiene niveles totalmente bajos de
partículas bien pequeñitas en cualquier
sílice ofrecida en el mercado cromatográfico
hoy en día. Sílice de grado flash con menos
partículas pequeñas provee una cama de
cromatografía regular, estable y
reproducible con un ritmo de flujo rápido y
constante.
Las partículas grandes
también son malas para el aislamiento del
producto y purificación. Tamaños grandes de
partículas hacen que el solvente fluya
rápidamente por la columna dañando la
separación. En una columna el solvente
tomará la vía de
menor resistencia fluyendo alrededor
de los bolsillos de partículas pequeñas. El
flujo desnivelado afecta
significantemente a la separación
cromatográfica, porque hace que cumbres de
rendimiento (yield peaks) tengan tiempos de
retención diferentes dependiendo de la vía
de flujo en la columna. Mientras el producto
está siendo aislado, sale de la columna, el
compuesto resulta en cumbres que pueden ser
anchas y escasamente separadas. La meta del
cromatógrafo
es producir un resultado lo más
definido posible.
Cuando las separaciones son
ejecutadas es sumamente importante comenzar
con una distribución limpia de tamaño de
partícula del gel sílice. Flujo desnivelado
de solvente por la columna resulta en
cumbres anchas que son pobremente separados
de otros componentes. La distribución de
partículas a más niveles provee picos
Gaussianos (de distribución normal) que son
mas definidos resultando en productos más
puros.
Varios manufactureros del gel sílice ofrecen
gel sílice de 40 micrones en tamaño. Con mas
del 90% del gel sílice en el rango definido
(32-63 micrones) el sílice de DAI flash
grade provee 18-24% mas consistencia que
cualquier otro vendedor competitivo. Nuestro
producto es diseñado y manufacturado para
satisfacer las especificaciones rigurosas de
nuestros clientes el
cual es usted, el científico de separación.
Los químicos de separación necesitan
entender que no todos los geles de sílice de
40-63 micrones son los mismos. Use el
producto de DAI superior de pureza alta y
tamaño de partícula limpia para sus
necesidades de separación. Los resultados
gratificantes le mostraran los beneficios,
con consistencia de paso a paso en los
resultados del producto.
Sorbente
Los
resultados fueron menos aceptables cuando
63-200 micras (70-230), de material fue
utilizado, pero mejoró notablemente cuando
una media de 40 Micras (32-63 micrones), el
material estaba en la columna. Igualmente
importante: Partículas de tamaño inferior a
40 micras no ofrece una mejora significativa
en la resolución de este sistema. Idealmente,
use la alumina “Flash” de los absorbentes
dinámicos INC. de 40 micras Cat. # 02061-25.
Aparatos
La columna es
un tubo de vidrio con fondo plano de 18
pulgadas con una llave de teflón Y coronado
con 24/40 de dosis estándar de vidrio común.
columnas sin Vidrio son generalmente
preferidas porque tienen menos volumen
muerto Que el tipo estándar”. Pero aun, el
grupo describe el flujo de control Como un
“simple variable dispositivo de purga.”
Sorbente de selección
Utilice una placa análitica de cromatografía
de capa delgada (TLC) para los disolventes y
para optimizar las Separaciones. El deseado
Rf de los componentes debe ser 0.35 con un
sRf De 0.15. Use las placas de cromatografía
de capa delgada(TLC) de los absorventes
dinamicos INC. para la alumina, 20x20, Cat.
# 82101, O la alumina F254, 20x20 Cat.
#82111. Los siguientes Alumina “Flash” de
los absorbentes Dynámicos Inc. son
recomendados: los números del catalogo
02061-25, 02061-05, 02061-1, 02826-5 serie
Flash Grado alumina.
Columna
de selección
Seleccione una columna que es de 10, 20, 40
mm de identificación basado en los
requisitos preparatorios.
Técnica
Envase gel sílice “Flash” en
una columna de tamaño apropiado a un nivel
de 6”-10” dependiendo en la resolución
requerida. Despacio déle un golpecito
verticalmente para empacar el gel. Asegure
el ensamble. Llénelo con solvente, presione
ligeramente para comprimir el Gel Sílice y
fuerce el solvente y aire por la columna. No
debe dejar que se seque la parte de arriba
de la columna.
Aplique una solución de
muestras de 20-25% y eluya a un ritmo de
flujo de 2 pulgadas/minuto.
Tiempo
Rápido. Toma generalmente 5
– 10 minutos.
Resultados
Cantidades en gramos.
Típicamente 0.5 – 2.0 gramos. Puede aumentar
a 10 gramos si menos resolución es requerida
y/o si columnas mas grandes son usadas.
Sumario
Cromatografía Flash es un
método de Cromatografía Liquida Preparativa
(Prep LC) rápida y eficiente en costo. Las
separaciones son basadas en resultados de
TLC tradicionalmente obtenidos y son
simplemente extrapolados a una
escala de prep. Lo mejor de todo es
que no es necesario un equipamiento
elaborado ni la compra de equipamiento
costoso