Información Técnica
Cromatografía de Capa Fina en la
Purificación de los Lípidos
Dr. Gary Witman, Dr. Mark
Moskovitz
La purificación
de los lípidos se ha convertido simple y
conveniente. Hace unos veinte años HPLC remplazo
cromatografía de gases preparativa como el
método de elección para el análisis de los
lípidos. Pero en estos días, preparación
comercial de placas de TLC con revestimiento
previo hacen precisamente un trabajo tan bueno
como HPLC y son mucho más cómodo de utilizar.
Además, cromatografía en capa fina es
francamente una herramienta barata de análisis,
una característica con gran mérito en tiempos de
restricciones presupuestarias. Placas de TLC de
alto rendimiento fabricado con gel de sílice o
alúmina preparada con uniforme de material de
pequeño tamaño de las partículas para la fase
estacionaria permite separaciones con excelentes
tiempos de elución corto. Como se explica más
adelante, en el análisis de los lípidos
complejos por TLC es simplemente una cuestión de
usar reactivos específicos de pulverización para
detectar determinados grupos funcionales de los
lípidos: la sencillez en el rendimiento no es
posible con HPLC. TLC es increíblemente
flexible, dado que se puede utilizar en la
adsorción, complejación fase reversa o modos,
como por ejemplo la separación de los
componentes lipídicos complejos integrados en
las membranas de células de mamíferos o en los
aceites vegetales. Al realizar un análisis
cuantitativo de estas separaciones de lípidos se
recomienda que el espesor de el absorbente
colocada sobre la placa preparada sea mayor que
para el análisis cualitativo.
No hay
tecnología de costo más bajo y de alta
resolución disponible para la detección de los
lípidos. De hecho, hay informes de que algunos
investigadores sustituyan institucional frascos
de mayonesa tamaño de las cámaras de TLC que
luego son cubiertos por una placa de vidrio
plano en el que realizan experimentos. Qué
manera de ser capaz de mantener los costes de
investigación abajo! Placas de TLC estándares
son de 20 cm de altura, con anchos variables. El
ancho de una carta con platos de TLC depende del
número de muestras que sean cromatografados.
Recomendamos el uso de un tamaño estándar
preparados comercialmente de placa de TLC, que
es de 20 x 20 cm.
Cromatografía
en capa fina (TLC) se utiliza actualmente para
dos diferentes métodos de análisis de lípidos.
En el primer enfoque, las diferentes clases de
lípidos están separadamente extraídos y luego
cada clase de lípidos se analiza a través de la
metodología única de TLC. En el segundo enfoque,
mezclas complejas de los lípidos se separan en
las placas de TLC y, a continuación se
caracteriza más. Las clases de lípidos se
dividen en lípidos neutros como los
triglicéridos (forma que se forma una molécula
de glicerol y tres ácidos grasos), los lípidos
polares como los fosfolípidos y colesterol.
Idealmente, los lípidos son depositadas en una
sola de alúmina o de gel de sílice de placa de
TLC con sistemas de solventes secuencial
corriendo en la misma dimensión. Relativamente
lípidos no polares como lípidos neutros, ácidos
grasos y colesterol migran a posiciones únicas
en la mitad superior del cromatograma, mientras
que los lípidos relativamente polares como los
fosfolípidos y esfingolípidos están separados en
la mitad inferior del cromatograma.
En el modo de
adsorción (gel de sílice o alúmina es un agente
absorbente excelente) una aplicación principal
es para la separación de clases de lípidos
diferente de tejidos animales y vegetales. A
través del uso de una fase móvil compuesta de
hexano y éter dietílico es simple de resolver
los lípidos simples como ésteres de colesterol,
triglicéridos, ácidos grasos libres, colesterol
y diacilgliceroles. Cuando se realiza una
separación en fase reversa utilizando placas de
TLC, todo, menos el flujo del disolvente es al
revés. Utilizando la técnica de los compuestos
en fase reversa polares se mueven más rápido que
los no polares y lo más polar que es el
disolvente, lo menos que cosas se mueven a la
placa.
En una carrera
de adsorción estándar, lípidos complejos, como
los fosfolípidos y glicolípidos permanecen en el
origen, y estos se pueden cuantificar como si
fueran una clase de lípidos único. Esto ofrece
beneficios sobre los lípidos de purificación por
HPLC. Si dos dimensiones procedimientos de TLC
se utilizan con los lípidos complejos, una mejor
resolución es posible que se puede lograr en un
solo plazo de HPLC. Cuando se realiza en dos
dimensiones de TLC, una excelente resolución
puede conseguirse utilizando el aluminio o
láminas de cristal de copia de seguridad.
Para el trabajo
de análisis de rutina, diez o más muestras se
pueden aplicar a una placa de 20 x 20 cm y luego
la cantidad de lípidos presentes pueden ser
cuantificadas por carbonización-densitometría,
que consiste en pulverizar la placa con un
oxidante y calefacción para carbonizar los
lípidos. Antes de usarlo, se recomienda que las
placas se activa con el calor a una temperatura
de 110 F por una hora. Los lípidos migran a lo
largo de la placa formando manchas únicas e
independientes en la placa. Entonces, para la
detección de puntos después de una carrera, en
la que el disolvente elegido en frente es capaz
de migrar hasta la mitad de la placa (aproximadamente
30 minutos) las placas se secan en el aire en
una campana de químicos a temperatura ambiente
durante 20 minutos. Todos los lípidos pueden ser
fácilmente visualizados con un solo medio de
contraste soluble en agua como amido 10B negro.
Este tinte preferentemente interactúa con
entidades relativamente no polares y cuando está
presente en una solución 1 M de cloruro de sodio
se asociará con manchas de lípidos en el
cromatograma.
El uso de este colorante amido negro es
generalizada y no ayudan a diferenciar los
compuestos de lípidos separados. Como una ayuda
a la identificación de clases de lípidos
separados, las placas de TLC se puede tratar con
una variedad de reactivos específicos para los
tipos de lípidos específicos. Las siguientes
ayudas actualmente están recomendadas:
-
Reactivo de
ninhidrina se muestra lípidos que contienen
aminoácidos, útiles para la identificación
de la fosfatidiletanolamina y la
fosfatidilserina.
-
Vapores de
yodo o de amonio molibdato de un aerosol de
ácido-perclórico o un aerosol de ácido
sulfúrico se pueden usar para revelar la
presencia de todos los materiales de los
lípidos.
-
Reactivos
dragendorff son específicos para la colina.
-
Dinitrofenilhidrazina y el reactivo de
Schiff son específicos para plasmalógenos (cualquier
grupo de fosfolípidos de glicerol con sede
en la que se sustituye un grupo de ácidos
grasos por un aldehído graso).
-
Hidroxilamina férrico aerosol cloruro de
ácido son específicos para los ácidos grasos
esterificados.
El poder de la
tecnología para la detección de lípidos de TLC
cuantitativo es impresionante. Es posible
detectar la presencia de 25 ng de fosfolípidos,
25 ng de colesterol, y 50 ng de lípidos neutros
y ácidos grasosos.
El uso de estas
herramientas simples, es posible identificar los
componentes de los lípidos y los lípidos
rápidamente y con alta especificidad.
Información Técnica
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Alúmina Introducción y panorama
